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PCR扩增的常见问题


  比方,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感触传染态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培育留宿,发生1000个菌落。转化率为: 发生菌落的总数/铺板DNA的总量。

  B)插入片断带有污染,使3`-T缺失,或抑止毗连,抑止转化。为此,将插入片断和pGEM-T正对照夹杂,再毗连。如低落了对照的菌落数,插入片断需纯化,或从头制备。如发生大量的蓝斑,插入片断污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

  PCR扩增后呈现的条带与估计的巨细不分歧,或大或小,或者同时呈现特同性扩增带 与非特同性扩增带。非特同性条带的呈现,其缘由:一是引物与靶序列不彻底互补、或引物聚合构成二聚体。二是Mg2+离子浓渡过高、退火温渡过低,及PCR轮回次数过多相关。其次是酶的质和量,往往一些来历的酶易呈现非特异条带而另一来历的酶 则不呈现,酶量过多有时也会呈现非特同性扩增。其对策有:需要时从头设想引 物。减低酶量或互换另一来历的酶。低落引物量,恰当添加模板量,削减轮回次数。恰当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃摆布退火与延长)。

  D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,毗连pGEM-T正对照,转化高频次感触传染态细胞(10(8次方)cfu/ug),依照指定的尝试步调,可得100个菌落,此中60%应为白斑,如发生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,毗连有问题。

  物理缘由:变性对PCR扩增来说相当主要,如变性温度低,变性时间短,极有可能呈现假阳性;退火温渡过低,可致非特同性扩增而低落特同性扩增效率退火温渡过高影响引物与模板的连系而低落PCR扩增效率。有时另有需要用尺度的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度,这也是PCR失败的缘由之一。

  PCR扩增有时呈现涂抹带或片状带或地毯样带。其缘由往往因为酶量过多或酶的品质 差,dNTP浓渡过高,Mg2+浓渡过高,退火温渡过低,轮回次数过多惹起。其对策有:削减酶量,或互换另一来历的酶。②削减dNTP的浓度。恰当低落Mg2+浓 度。添加模板量,削减轮回次数。

  PCR反映的环节关键有①模板核酸的制备,②引物的品质与特同性,③酶的品质及, ④PCR轮回前提。寻找缘由亦应针对上述关键进行阐发钻研。

  若有菌落,表白氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或发生氨苄抗型的菌落。

  Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓渡过高可低落PCR扩增的特 同性,浓渡过低则影响PCR扩减产量以至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

  E)高度反复序列可能会不不变,在扩增中发生缺失和重排,如发觉插入片断高频次地发生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞

  靶序列变异:如靶序列产生突变或缺失,影响引物与模板特同性连系,或因靶序列某 段缺失使引物与模板得到互补序列,其PCR扩增是不会顺利的。

  引物设想不符合:取舍的扩增序列与非目标扩增序列有同源性,因此在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产品为非目标性的序列。靶序列太短或引物太短,容易呈现假阴性。需从头设想引物。

  正常为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型犯警则以至消逝。

  如凝胶阐发扩减产品只要一条带,不必要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是堆集了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会发生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目标插入片断。为此需在克隆前做凝胶纯化。

  C)如用pGEM-T正对照,或PCR产品,发生20-40蓝斑(用指定步调10(8次方)cfu/ ug感触传染态细胞),表白载体得到T。可能是毗连酶污染了核酸酶。T4DNA毗连酶(M1801,M1804,M1794)品质尺度好无核酸酶污染,不使用其它来历的T4 DNA毗连酶替代。

  D)带有修复功效的耐热DNA聚合酶的扩减产品结尾无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在结尾加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体手艺材料(TM042)。

  可选中1个或多个下面的环节词,搜刮有关材料。也可间接点“搜刮材料”搜刮整个问题。

  靶序列或扩减产品的交叉污染:这种污染有两种缘由:一是整个基因组或大片断的交叉污染,导致假阴性。这种假阴性可用以下方式处理:操作时应小心温柔,预防将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不克不迭耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪甲等均应一次性利用。需要时,在加标本前,反映管和试剂用紫外线映照,以粉碎具有的核酸。二是氛围中的小片断核酸污染,这些小片断比靶序列短,但有必然的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产品,而导致假阴性的发生,可用巢式PCR方式来减轻或消弭。

  C)插入片断不适于毗连。用凝胶纯化的插入片断,因受UV过分映照,时有产生。UV过分映照会发生嘧啶二聚体,晦气于毗连,DNA必须从头纯化。

  反映体积的转变:凡是进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,使用多大要积进行PCR扩增,是按照科研和临床检测分歧目标而设定,在做小体积如20ul 后,再做大要积时,必然要模索前提,不然容易失败。

  酶失活:需改换新酶,或新旧两种酶同时利用,以阐发能否因酶的活性损失或不敷而 导致假阳性。需留意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

  引物:引物品质、引物的浓度、两条引物的浓度能否对称,是PCR失败或扩增条带不 抱负、容易弥散的常见缘由。有些批号的引物合成品质有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,形成低效率的不合错误称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不只有看OD值,更要重视引物原液做琼脂糖凝胶电泳,必然要有引物条带呈现,并且两引物带的亮度应大要分歧,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单元协商处理。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要均衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保留,预防多次冻融或持久放冰箱冷藏部门,导致引物变质降解失效。④引物设想不正当,如引物长度不敷,引物之间构成二聚体等。

  模板:①模板中含有杂卵白质,②模板中含有Taq酶抑止剂,③模板中卵白质没有消 化除净,出格是染色体中的组卵白,④在提取制备模板时遗失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不完全。在酶和引物品质好时,不呈现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取历程出了弊端,因此要配制无效而不变的消化处置液,其法式亦应 固定不宜随便更改。

  铺板DNA的总量是转化反映所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:

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